【明天10-11点】
【739/740明天中午放出】
研究背景
尽管在手术、放疗和分子靶向治疗方面取得了进展，非小细胞肺癌的死亡率仍然很高。针对程序性细胞死亡蛋白配体1(pd-l1)程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)轴的icis通过激活细胞毒性t细胞活性来促进肿瘤细胞的杀伤。虽然这些抑制剂已经被批准用于晚期nsclc的治疗，但由于肿瘤微环境(tme)中存在多种免疫抑制屏障，大多数患者几乎没有临床获益。因此，迫切需要努力寻找能够克服这些屏障，提高icis疗效的免疫调节剂。rt具有潜在的免疫调节特性，因为它可以触发免疫原性细胞死亡和激活抗原提呈细胞，使肿瘤特异性t细胞交叉激活，不仅可以限制原发肿瘤的生长，还可以产生针对远处(非内窥镜)转移灶的全身性效应。不幸的是，最佳的rt剂量和潜在的分子机制取决于癌症的类型，对于非小细胞肺癌，包括诱导最佳免疫调节的测序和剂量/分割方案，目前还知之甚少。新出现的证据支持icis和rt联合治疗包括nsclc在内的各种肿瘤类型的可能性。一项i期试验显示，以前接受过放射治疗的nsclc患者在接受icis治疗的情况下比没有接受过rt治疗的患者有更长的无进展生存期。然而，由于之前的试验缺乏确定的分子机制，目前的临床试验测试这种组合是由经验选择指导的，而这些选择可能并不是最优的。在这里，我们提供了机械性的见解，可能会加速非小细胞肺癌rt和icis联合治疗的发展。
❀技术路线❀
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❀研究结果❀
特定剂量的rt可增强pd-1阻滞剂的疗效
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在正在进行的人类和鼠肿瘤的研究中，已经报道了不同剂量的低分割rt，并提出了剂量和分割的关键重要性。因此，我们首先优化了微计算机断层扫描(µct)引导下的hkp1荷瘤肺rt方案，该方案可以提高pd-1抑制的治疗效果。我们测试了一种先前报道在乳腺癌模型中具有免疫调节活性的rt方案：8gy连续3天(8gy×3)，以及两种较低剂量的方案，4gy×3和0.5gy×3(图1a)。值得注意的是，4gy×3(4gy-rt)联合pd-1抗体可显著控制肿瘤(图1b，c)并提高存活率(图1d)。此外，40%的小鼠无瘤存活，而仅接受pd-1抗体治疗的队列小鼠的无瘤存活率为10%。与单独抑制pd-1相比，0.5gy×3和8gy×3的其他剂量联合pd-1抑制并不能显著控制肿瘤或提高生存率(图1e，f)。
通过联合治疗获得持久的t细胞活性
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为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1d(放疗开始后第4天)检测了t细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4gy-rt显示在肿瘤胰岛浸润的cd8+t细胞数量最多(图2a和扩展数据图1a)，在hkp1肺中干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-α+/cd4+t细胞和gzmb+/cd8+t细胞数量最多(图2b，c和扩展数据图1b)。这些4gy-rt诱导的t细胞活性与其抑制pd-1的协同作用是一致的。越来越多的t细胞被招募到hkp1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为cd4+t细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(扩展数据图2a，b)。为了确定4gy-rt是否增强了原有t细胞的功能，我们用s1p受体抑制剂fty720治疗hkp1小鼠，fty720可以阻止活化的t细胞从淋巴结流出(扩展数据图2c)。正如预期的那样，fty720治疗通过减少循环t细胞(扩展数据图2d)，将4gy-rt的效果局限于肺部原有的t细胞。与对照组相比，fty720取消了4gy-rt增加干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-α+/cd4+t细胞和gzmb+/cd8+t细胞的能力(扩展数据图2e)。因此，在fty720处理的小鼠中，4gy-rt和抗pd-1联合治疗的效果被取消(扩展数据图2f)。这些发现表明，4gy-rt并不能重新激活tme中原有的功能紊乱的t细胞。
4gy-rt治疗可激活tme中的肺驻留棒状细胞
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为了探索4gy-rt诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了rt诱导的树突状细胞(dc)的激活。4gy-rt治疗既没有引起肿瘤细胞死亡(扩展数据图4a)，也没有增加支气管淋巴结中cd103+交叉呈递的dc(扩展数据图4b)。接下来，我们对接受rt(0gy、4gy或8gy×3)联合igg或pd-1抗体治疗的hkp1肺进行rna-seq分析。比较4gy-rt组、0gy(模拟)组和8gy-rt(无效剂量)组在抗pd-1治疗前后的差异表达基因(p<0.01，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将igg队列中4gy-rt上调的基因与抗pd-1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个gy-rt特征基因的细胞来源，我们对接受0gy或4gy-rt的hkp1荷瘤肺进行了单细胞rna-seq(scrna-seq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(t-sne)图，我们发现这些基因在4gy-rt后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。
棒状细胞分泌体与联合治疗的疗效有关
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无论采用哪种耗竭方法，携带hkp1的肺对4gy-rt的免疫反应均明显减弱，表现为t细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(cd4+t细胞中的干扰素-γ/肿瘤坏死因子-α和cd8+t细胞中的gzmb)(图4c和扩展数据图6d)。值得注意的是，在hkp1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。
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电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4gy-rt治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高icis疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用scgb1a1-creertm/snap23flox/flox转基因小鼠(简称scgb1a1cre/snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺tme。突触体相关蛋白23(snap23)是snare复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗scgb1a1cre/snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(balf)的分析证实，与野生型对照相比，4gy-rt治疗的scgb1a1cre/snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分cc10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，snap23缺乏抑制了hkp1肺对4gy-rt反应中t细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。